酵母点对点三缺培养基长，四缺培养基不长，能说明有互作吗？

截至目前，我仅完成了酵母单杂和酵母双杂两个实验项目。在酵母单杂实验中，我主要使用了pGADT7与pAbAi或pHis2的载体组合。值得注意的是，酵母单杂实验并不需要四缺培养基，而是根据所选的载体系统来确定培养基的组成。对于pAbAi系统，我们只需在缺Leu的培养基上添加对应的AbA抗生素；而pHis系统则需在三缺板SD/-Leu/-Trp/-His上进行，无需使用四缺培养基。

通常而言，四缺培养基更多地应用于酵母双杂或更复杂的实验中。在酵母双杂实验中，四缺培养基指的是SD/-Leu/-Trp/-His/-Ade。His和Ade作为报告基因，当两个蛋白发生互作时，它们能够启动合成必要的营养素，从而支持酵母在培养基上的生长。为确保结果的准确性，酵母双杂实验还会采用多个报告基因，如X-α-gal或X-gal显色基因，以排除假阳性现象。

在酵母杂交实验中，尤其是单杂实验，假阳性是一个常见问题。由于BD连接的是启动子，而AD连接的往往是转录因子基因，BD可能会因启动子的特性而产生自激活现象，导致假阳性结果。为了解决这个问题，我们通常使用AbA或3AT来筛选浓度，以减少背景干扰。然而，这种方法的效果并不总是尽如人意。

在单杂实验中，我们有时会遇到一些令人困惑的现象。例如，在单独转化BD后筛选到的AbA或3AT浓度足以抑制酵母生长，但在共转AD和BD后，空载的AD却能在原本应被抑制的抗生素浓度的缺素培养基上生长，且生长状况甚至优于实验组。此外，共转后的多次验证实验也常常出现结果不一致的情况，这增加了实验的不确定性和复杂性。

相较于酵母单杂，我认为酵母双杂的结果更为可靠，这主要得益于其使用的多个报告基因。这些报告基因可以相互验证，从而增加实验的准确性。然而，酵母双杂同样面临一些问题，特别是在筛选浓度后的共转过程中，空载的AD有时也能生长。这种情况在验证转录因子之间的互作时尤为常见，可能是因为转录因子本身具有较强的自激活现象。针对这一问题，我们通常采用截短分析的方法来解决。

对于酵母双杂实验，如果空白AD与带有目的蛋白的BD共转（作为阴性对照）在三缺板上能生长而在四缺板上不能生长，这可能意味着两者之间存在轻微的互作，或者BD具有自激活现象。然而，由于四缺板上不长，因此这个组合仍可用作阴性对照，与实验组进行对比。相反，如果实验组在四缺板上不能生长，则表明两个蛋白之间没有发生互作。只有互作发生，酵母才能在四缺板上生长。

如果你使用的是Y2HGold或Y187体系，还可以利用X-α-gal溶液进行涂板。如果出现蓝色，则证明两个蛋白可以发生互作。通过综合考虑抗生素浓度、His、Ade以及显色反应等因素，我们可以得出酵母双杂实验中最为可靠的结果。