1、在缓冲液中加入甲醇的目的是促使SDS的游离，并增加膜结合蛋白的数量。然而，过量的甲醇可能导致凝胶收缩，使得大分子在凝胶中沉淀，从而降低转膜效率。对于分子量较大的蛋白质（例如大于60kDa），建议采用低浓度的甲醇或完全不使用甲醇。

2、检查电转移效果的方法包括：①利用考马斯亮兰染色技术对电转移后的凝胶进行染色，以观察是否仍有蛋白质残留；②通过丽春红染色法检查膜上是否吸附了蛋白质。

3、在电转移方法中，湿式电转通常具有更高的效率，而半干式电转则具有较快的转移速度。

4、阻断剂的种类多样，如BSA、Tween-20、脱脂奶粉以及其他动物血清等。这些阻断剂的效果并不完全相同，若实验中发现背景过高，可以尝试更换不同的阻断剂。

5、一抗和酶标二抗的浓度对于实验结果至关重要。浓度过高可能导致背景过高，而浓度过低则可能导致灵敏度下降。因此，在实验过程中，需要根据一抗和酶标二抗的效价来优化这些参数。此外，一抗的质量也至关重要，其特异性和效价会直接影响实验结果。

6、为了避免假阳性反应的影响，需要严格控制实验条件。可以使用免疫前血清作为阴性对照，并以抗原作为绝对的阳性对照，从而准确确定阳性条带的位置。